AOBB95/SOP11/01 روش عملكردي استاندارد (SOP) ا زمايش Rh(D) به روش لوله اي هدف/ اصول: 1) تعيين گروه Rh(D) گلبول قرمز خون بصورت فنوتيپ Rh-Positive و Rh-Negative با توجه به حضور و عدم حضور ا نتيژن D در سطح غشاي گلبول قرمز خون 2) شناساي ي ا نتيژنهاي ضعيف D و تعيين فنوتيپ Weak) D) در صورت لزوم(نوزادان متولد شده از مادر Rh-Negative و افراد اهدا كننده خون) موارد/دامنه كاربرد: 1) بانك هاي خون بيمارستاني و مراكز مصرف كننده خون و فرا ورده هاي خوني. نمونه: 1) مقدار 2-5 ميلي ليتر خون كامل نمونهگيري شده در لوله حاوي ضد انعقاد EDTA براي ا زمايش تعيين Rh قابل قبول است. 2) در صورت عدم وجود نمونه خون كامل حاوي EDTA استفاده از خون لخته بلا مانع است( به دستور العمل توليد كننده معرفها رجوع شود). 3) از نمونههاي ي كه ظاهر هموليز يا ليپيمي (hemolyzed lipemic) دارند استفاده نكنيد و نمونهگيري مجدد انجام شود. 4) نمونههاي خون در دماي يخچال 2-8 درجه سانتيگراد و به مدت حداقل 7 روز جهت هرگونه ا زمايش بعدي ذخيره شود( به دستورالعمل توليد كننده معرفها جهت محدوديت و شرايط ذخيره سازي نمونهها رجوع شود). 5) جهت پيشگيري از وقوع هرگونه خطاي انساني جداسازي سرم يا پلاسما از گلبول قرمز خون نمونه بيمار و ذخيره سازي در لوله هاي تفكيك شده توصيه نميشود. تجهيزات مواد و لوازم مورد نياز:
روش هاي عملكردي استاندارد (SOPs) فعاليت بانك خون و بخش هاي مصرف كننده خون و فرا ورده هاي ا ن 1) معرف مناسب Anti-D 2) لوله ا زمايش 75*12 ميلي متر 3) سانتريفوژ سرولوژيك كاليبره شده 4) ا ينه مقعر و منبع روشنايي 5) سالين 0/9 درصد (6 محلول 6% Albumin 7) پيپت يكبار مصرف يا پيپت 50 λ وλ 100 AHG(Anti IgG Monospecific) (8 (9 گلبولهاي قرمز حساس شده IgG sensitized check cells 10) جا لولهاي 11) بن ماري 37 درجه سانتيگراد نكات ايمني: 1 )استفاده از دستكش و عينك محافظ در هنگام كار 2 )وجود سيفتي باكس جهت دفع كليه مواد بيولوژيك و زباله هاي تيز و برنده فرم و مستندات: 1) دفاتر ثبت نتايج گروه خون 2) نتايج ثبت شده در نرم افزار بيمارستاني كنترل كيفي: 1) مطابق با روش عملكردي استاندارد كنترل كيفي روزانه (AOBB95/SOP03/01) ٢
روش عملكردي استاندارد (SOP) ا زمايش Rh(D) به روش لوله اي مراحل اجرا: 1) مقدار مناسب Anti-D بر اساس دستورالعمل سازنده به لولهاي كه از قبل نشانهگذاري شده اضافه نماييد. 2) حجم مشابه با بند 1 از محلول 6% Albumin را به لوله دوم كه از قبل نشانه گذاري شده اضافه نماييد. 3) به هر يك از لولههاي فوق يك قطره ازسوسپانسيون گلبول قرمز (2-5 درصد) اضافه نماييد. 4) محتواي داخل لوله ها را به ا رامي مخلوط نماييد و مطابق زمان و سرعت مندرج در دستورالعمل توليد كننده سانتريفوژ نماييد. معمولا زمان 15-30 ثانيه با دور *1000 g -900 مي باشد. 5) لوله ها را به ا رامي تكان دهيد تا توده گلبولي به صورت سوسپانسيون ا زاد شود و وجود هرگونه ا گلوتيناسيون را مشاهده درجه بندي و نتايج را ثبت كنيد.. 6) در صورت مشاهده ا گلوتيناسيون در لوله Anti-D و سوسپانسيون يكدست و بدون ا گلوتيناسيون در گزارش كنيد. لوله 6% Albumin نتيجه ا زمايش را Rh(D)-Positive 7) در مورد ا زمايشات پيش از تزريق جهت دريافت كنندگان خون در صورت مشاهده سوسپانسيون يكدست و بدون ا گلوتيناسيون در هر دو لوله و Albumin 6% Anti-D نتيجه ا زمايش را Rh(D)-Negative گزارش كنيد و نيازي به انجام ا زمايش D Weak و ادامه مراحل نمي باشد. در خصوص تعيين گروه خوني Rh در نوزادان متولد شده از مادر Rh-Negative و همچنين اهدا كنندگان خون مراحل را جهت تعيين فنوتايپ D Weak به صورت زير ادامه دهيد: 8) هر دو لوله را مطابق دستورالعمل سازنده انكوبه نماييد. معمولا به مد ت 15-30 دقيقه در دماي 37 درجه سانتيگراد مي باشد. ٣
روش هاي عملكردي استاندارد (SOPs) فعاليت بانك خون و بخش هاي مصرف كننده خون و فرا ورده هاي ا ن 9) پس از طي زمان انكوباسيون لولهها را سانتريفوژ نماييد. معمولا زمان 15-30 ثانيه با دور 10) لوله ها را به ا رامي تكان دهيد تا توده گلبولي به صورت سوسپانسيون ا زاد شود. وجود هرگونه ا گلوتيناسيون را مشاهده درجه بندي و نتايج را ثبت كنيد. 11) در صورت مشاهده ا گلوتيناسيون در لوله Anti-D و سوسپانسيون يكدست و بدون ا گلوتيناسيون در لوله 6% Albumin نتيجه ا زمايش را Rh(D)-Positive گزارش كنيد و U مرحله AHG لازم ني ست. 12) در صورت عدم مشاهده تغييري در واكنش يا وجود واكنش مشكوك لوله ها را سه تا چهار بار با سالين به صورت كامل شستشو دهيد. 13) پس از ا خرين شستشو لوله ها را خوب از سالين تخليه كرده و مطابق دستورالعمل سازنده AHG به لولهها اضافه نماييد. 14) محتواي لولهها را به ا رامي مخلوط كرده و مطابق زمان و سرعت مندرج در دستورالعمل 15) لوله ها را به ا رامي تكان دهيد تا توده گلبولي به صورت سوسپانسيون ا زاد شود. وجود هرگونه ا گلوتيناسيون را مشاهده درجه بندي و نتايج را ثبت كنيد. 16) در صورت مشاهده ا گلوتيناسيون در لوله Anti-D و سوسپانسيون يكدست و بدون ا گلوتيناسيون در لوله 6% Albumin نتيجه ا زمايش را Rh(D)-Positive گزارش كنيد. 17) اگر واكنش هر دو لوله منفي باشد يك قطره گلبول قرمز حساس شده IgG sensitized check cells به هر يك از لولهها اضافه كنيد. g*1000-900 مي باشد. توليد كننده سانتريفوژ نماييد. معمولا زمان 15-30 ثانيه با دور g*1000-900 مي باشد. 18) لولهها را سانتريفوژ نماييد. معمولا زمان 15-30 ثانيه با دور g*1000-900 مي باشد. 19) لوله ها را به ا رامي تكان دهيد تا توده گلبولي به صورت سوسپانسيون ا زاد شود. وجود هرگونه ا گلوتيناسيون را مشاهده درجه بندي و نتايج را ثبت كنيد. نكات: انجام ا زمايش دوم Rh(D) بر روي نمونه خون بيمار با استفاده از معرف دوم و با كلون ا نتي D متفاوت جهت شناساي ي ا نتيژنهاي ضعيف Rh(D) توصيه ميشود. ٤
U روش عملكردي استاندارد (SOP) ا زمايش Rh(D) به روش لوله اي جهت تهيه 6% Albumin مي توان محلولهاي تجاري 22% Albumin را بصورت 3 به 8 با نرمال سالين رقيق كرد( 3 حجم 22% Albumin را به 8 حجم نرمال سالين اضافه ميكنيم كه حجم نهايي 11 مي شود.) تفسير: 1) در صورت مشاهده ا گلوتيناسيون در لوله Anti-D پس از مراحل 37 درجه سانتيگراد و يا AHG و عدم مشاهده ا گلوتيناسيون در لوله 6% Albumin بايد نتيجه ا زمايش ب ص و ر ت " " Rh(D)- Positive گزارش شود. گزارش نتيجه ب ه ش كل اشتباه و غلط ميباشد. " و Positive" " Weak U " منفيD " و " مثبت DPU UP 2) عدم مشاهده ا گلوتيناسيون در لوله حاوي Anti-D و Rh-Control نشان دهنده عدم وجود ا نتي ژن D در س طح غش اي گلب ول قرمزخ ون م يباش د و بايد نتيجه ا زمايش بصورت "Rh(D)-Negative" گزارش شود. 3) در صورتي كه در لوله 6% Albumin هرگونه ا گلوتيناسيون مشاهده شود نتيجه ا زمايش Unresolved گزارش شده و غيرقابل تفسير ميباشد و درصورت نياز بيمار به خون ازگروه " Rh(Negative) " تزريق شود. 4) در صورتيكه پس از اضافه نمودن گلبول قرمز خون حساس شده نتيجه واكنش منفي شود يكي از موارد زير اتفاق افتاده است و ا زمايش بايد پس از رفع منبع خطا تكرار شود : معرف AHG اضافه نشده است. مع رف AHG اضافه شده ولي با توجه به وجود سالين باقي مانده يا عدم شستشوي مناسب ا نتيباديهاي ا زاد خنثي شده است. معرف AHG داراي توان واكنش (potency) مناسب نيست. ٥
روش هاي عملكردي استاندارد (SOPs) فعاليت بانك خون و بخش هاي مصرف كننده خون و فرا ورده هاي ا ن محدوديت: 1) فقط واكنشهاي ي كه به صورت ماكروسكوپي macroscopic مشاهده ميشود قابل گزارش ميباشد. از ميكروسكوپ جهت مشاهده واكنشهاي ضعيف در ا زمايش تعيين ا نتيژن Rh(D) استفاده نكنيد. 2) معرفهاي تجاري موجود در بازار به صورت IgM monocolonal و يا مخلوط IgM كه فقط شامل anti-d مي باشند. بايد توجه داشت معرف هاي IgG&IgM Blend مي باشند جهت ا زمايش Weak-D مناسب نيستند و بايد از معرف ها ي anti-d كه حاوي IgG مي باشند استفاده نمود. 3) در بانك خونهاي مراكز بيمارستاني و ا زمايشگاههاي تشخيص طبي انجام ا زمايش ABO & Rh با استفاده از اسلايد ممنوع ميباشد. ٦